Perbedaan utama antara helikase dan topoisomerase adalah bahwa helikase adalah enzim yang memisahkan dua untai pelengkap DNA dengan memutus ikatan hidrogen antara basa dua untai sementara topoisomerase adalah enzim yang menghilangkan superkoil positif dan negatif yang terbentuk selama proses pelepasan DNA dengan memotong dan menyegel kembali satu atau kedua untai dupleks DNA.
DNA adalah heliks ganda. Itu ada dalam dua untai komplementer yang terikat bersama melalui ikatan hidrogen. Replikasi DNA, transkripsi, dan perbaikan DNA memerlukan dua untai dipisahkan satu sama lain untuk membuat salinan baru, membuat mRNA, dan menambahkan nukleotida untuk diperbaiki. Kedua enzim helikase dan topoisomerase berperan pada saat ini. Oleh karena itu, baik helikase maupun topoisomerase sangat penting dalam pelepasan DNA. Helikase memisahkan DNA untai ganda menjadi untai tunggal dengan memutus ikatan hidrogen antara pasangan basa nukleotida dalam DNA untai ganda. Sebaliknya, topoisomerase mengurai twist DNA dan mengurangi sifat superkoil DNA dengan memotong tulang punggung DNA fosfat baik dalam satu atau kedua untai.
