Perbedaan Utama - Urutan Sanger vs Pyrosequencing
Pengurutan DNA sangat penting untuk analisis DNA karena pengetahuan tentang susunan nukleotida yang benar pada wilayah DNA tertentu mengungkapkan banyak informasi penting tentangnya. Ada beberapa metode pengurutan DNA. Sanger sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA berbeda yang banyak digunakan dalam Biologi Molekuler. Perbedaan utama antara sekuensing Sanger dan Pyrosequencing adalah sekuens Sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menghentikan sintesis DNA untuk membaca sekuens nukleotida sementara pyrosequencing mendeteksi pelepasan pirofosfat dengan memasukkan nukleotida dan mensintesis sekuens komplementer untuk membaca urutan urutan yang tepat.
DAFTAR ISI
1. Ikhtisar dan Perbedaan Utama
2. Apa itu Urutan Sanger
3. Apa itu Pyrosequencing
4. Perbandingan Berdampingan - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Ringkasan
Apa itu Sanger Sequencing?
Sanger sequencing adalah metode sekuensing DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan koleganya pada tahun 1977. Metode ini juga dikenal sebagai Chain Termination Sequencing atau Dideoxy sequencing karena didasarkan pada penghentian rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Metode ini digunakan secara luas selama lebih dari 30 tahun hingga New Generation Sequencing (NGS) dikembangkan. Teknik sekuensing sanger memungkinkan penemuan urutan nukleotida yang benar atau keterikatan fragmen DNA tertentu. Ini didasarkan pada penggabungan selektif ddNTP dan penghentian sintesis DNA selama replikasi DNA in vitro. Tidak adanya gugus 3 'OH untuk melanjutkan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan adalah fitur unik ddNTPs. Oleh karena itu, setelah ddNTP dipasang, pemanjangan rantai berhenti dan berhenti dari titik tersebut. Ada empat ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - digunakan dalam pengurutan Sanger. Nukleotida-nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA ketika mereka dimasukkan ke dalam untaian DNA yang sedang tumbuh dan menghasilkan panjang DNA pendek yang bervariasi. Elektroforesis gel kapiler digunakan untuk mengatur untaian DNA pendek ini berdasarkan ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01.
Gambar 1: Elektroforesis gel kapiler DNA pendek yang disintesis
Untuk replikasi DNA in vitro, hanya sedikit persyaratan yang harus disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA cetakan, primer oligonukleotida, dan deoksinukleotida (dNTPs). Dalam sekuens Sanger, replikasi DNA dilakukan di empat tabung reaksi terpisah bersama dengan empat jenis ddNTP secara terpisah. Deoksinukleotida tidak sepenuhnya digantikan oleh ddNTP masing-masing. Campuran dari dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) dimasukkan ke dalam tabung dan direplikasi. Empat produk tabung terpisah dijalankan pada gel di empat sumur terpisah. Kemudian dengan membaca gel, barisan dapat dibuat seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.
Gambar 02: Pengurutan Sanger
Pengurutan sanger adalah teknik penting yang membantu di banyak bidang biologi molekuler. Proyek genom manusia berhasil diselesaikan dengan bantuan metode berbasis sekuens Sanger. Pengurutan sanger juga berguna dalam pengurutan DNA target, penelitian kanker dan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, identifikasi manusia, deteksi patogen, pengurutan mikroba, dll.
Ada beberapa kelemahan pengurutan Sanger:
- Panjang DNA yang sedang diurutkan tidak boleh lebih dari 1000 pasangan basa
- Hanya satu untai yang dapat diurutkan dalam satu waktu.
- Prosesnya memakan waktu dan mahal.
Oleh karena itu, teknik pengurutan lanjutan baru dikembangkan seiring waktu untuk mengatasi masalah ini. Namun, pengurutan Sanger masih digunakan karena hasil yang sangat akurat hingga kira-kira 850 fragmen panjang pasangan dasar.
Apa itu Pyrosequencing?
Pyrosequencing adalah teknik sekuensing DNA baru berdasarkan "sekuensing dengan sintesis". Teknik ini bergantung pada deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeda: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.
Prosesnya dimulai dengan pengikatan primer dengan templat DNA untai tunggal dan DNA polimerase memulai penggabungan nukleotida yang melengkapi itu. Ketika nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asam nukleat), ia melepaskan gugus pirofosfat (dua gugus fosfat terikat bersama) dan energi. Setiap adisi nukleotida melepaskan pirofosfat dalam jumlah yang sama. Pirofosfat diubah menjadi ATP oleh ATP sulfurylase dengan adanya APS substrat. ATP yang dihasilkan mendorong konversi luciferase-mediated luciferin menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya tampak dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dideteksi oleh perangkat pendeteksi foton atau pengganda foto dan membuat sebuah program. Apyrase menurunkan ATP dan dNTP yang tidak tergabung dalam campuran reaksi. Penambahan dNTP dilakukan satu kali dalam satu waktu. Karena penambahan nukleotida diketahui sesuai dengan penggabungan dan deteksi cahaya, urutan cetakan dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida dari sampel DNA seperti yang ditunjukkan pada Gambar 03.
Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan sekuensing bentangan pendek DNA. Akurasi tinggi, fleksibilitas, kemudahan otomatisasi, dan pemrosesan paralel adalah keunggulan pyrosequencing dibandingkan teknik sekuensing Sanger.
Gambar 03: Pyrosequencing
Apa perbedaan antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing?
Artikel Diff Tengah sebelum Tabel
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger sequencing adalah metode sekuensing DNA berdasarkan penggabungan selektif ddNTP dengan DNA polimerase dan penghentian rantai. | Pyrosequencing adalah metode sekuensing DNA berdasarkan deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. |
| Penggunaan ddNTP | |
| ddNTPs digunakan untuk menghentikan replikasi DNA | ddNTP tidak digunakan. |
| Enzim terlibat | |
| DNA polimerase digunakan. | Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase. |
| Substrat yang Digunakan | |
| APS dan Luciferin tidak digunakan. | Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan. |
| Suhu Maksimum | |
| Ini adalah proses yang lambat. | Ini adalah proses yang cepat. |
Ringkasan - Urutan Sanger vs Pyrosequencing
Sanger sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang digunakan dalam biologi molekuler. Pengurutan sanger menyusun urutan nukleotida secara berurutan dengan menghentikan pemanjangan rantai sementara pyrosequencing menyusun urutan nukleotida yang tepat secara berurutan dengan memasukkan nukleotida dan mendeteksi pelepasan pirofosfat. Oleh karena itu, perbedaan utama antara sekuens Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa sekuens Sanger bekerja pada sekuensing dengan penghentian rantai sementara pyrosequencing bekerja pada sekuens dengan sintesis.
